Co to jest białko p16 i jaka jest jego funkcja?

Białko p16 (inaczej białko p16INK4a, inhibitor kinazy cyklinowej 2A, CDKN2A) jest jednym z kluczowych białek kontrolujących prawidłowy przebieg cyklu komórkowego. Jest częścią kaskady sygnałów tzw. punktu restrykcyjnego (inaczej punktu kontrolnego) przejścia fazy G1 w fazę S w cyklu komórkowym. Aktywne białko P16 rozpoczyna ciąg zdarzeń, który doprowadza do zatrzymania podziału komórki (komórka nie przechodzi z fazy G1 do fazy S). Przypominamy, że faza G1 cyklu komórkowego, to faza, w której komórka przygotowując się do podziału zaczyna syntezę dużej ilości białek, rośnie, powiększa swoją masę i objętość. Następnie w fazie S komórka powiela (duplikuje) swój materiał genetyczny. Blokada cyklu komórkowego pomiędzy fazą G0 a fazą S powoduje, że komórka przestaje się namnażać. Więcej informacji na temat cyklu komórkowego i podziału komórek znajdziesz w artykule GAMETOGENEZA. W prawidłowych komórkach poziom P16 będzie więc wysoki w przypadku komórek dojrzałych, wyspecjalizowanych, które nie ulegają już podziałom, a niski w komórkach młodych, różnicujących się. 

Dzięki temu, że białko p16 hamuje podziały komórkowe, białko to pełni również rolę białka supresorowego nowotworów (poprzez blokadę przejścia komórki z fazy G1 do fazy S hamuje podziały komórkowe, a więc hamuje możliwość wzrostu i różnicowania się komórek nowotworowych). W badaniach wykazano, że ekspresja białka p16 w komórkach rośnie pod wpływem działania czynników onkogennych, np. wirusów, reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), uszkodzeń DNA. 

Białko p16 w skriningu raka szyjki macicy

Rak szyjki macicy jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych nowotworów kobiecych. W 2020 roku diagnozę raka szyjki macicy usłyszały 3862 Polki, co daje mu 6 miejsce wśród nowotworów złośliwych kobiet. Równocześnie w tym samym roku odnotowano w Polsce 2137 zgonów z powodu raka szyjki macicy (7 miejsce wśród nowotworów kobiecych). Główną przyczyną (99% zachorowań) raka szyjki macicy jest zakażenie wirusem HPV, czyli wirusem brodawczaka ludzkiego (ang. human papilloma virus). Jeśli chcesz przeczytać więcej o drogach zakażenia wirusem HPV, objawach zakażenia, wykrywaniu HPV i leczeniu – przeczytaj artykuł HPV. Przetrwała infekcja HPV może doprowadzić do wbudowania części genów wirusa w genom zainfekowanej wirusem komórki człowieka lub do uszkodzenia genów tej komórki. Taka zmieniona komórka zaczyna się dzielić w niekontrolowany sposób , co prowadzi do powstania rak szyjki macicy. Wykazano, że w komórkach zakażonych wirusem HPV występuje nadekspresja białka p16. Pomimo wysokiego poziomu p16, komórki zakażone HPV nadal proliferują, czyli pomimo, że zostaje aktywowane jedno z białek supresorowych nowotworu – p16, nie dochodzi do blokady namnażania się komórek nowotworowych. Dlaczego tak się dzieje? W dużym uproszczeniu mechanizm ten wygląda następująco. Białko p16 hamuje aktywność kinaz cyklinowych (CDK). Kinazy cyklinowe tworząc kompleksy z cyklinami wpływają (fosforylują) na kolejne białko supresorowe – białko Rb (retinoblastoma protein). Białko Rb w postaci nieufosforylowanej tworzy kompleks z czynnikiem transkrypcyjnym E2F (kompleks Rb-E2F), co powoduje, że E2F jest niedostępne i nie może wpływać na transkrypcję genów związanych z syntezą DNA. Po ufosforylowaniu Rb za pośrednictwem kompleksów cykliny – CDK czynnik transkrypcyjny E2F zostaje uwolniony, co rozpoczyna fazę S, w której dochodzi do replikacji DNA.

Jeżeli aktywność kinaz cyklinowych zostanie zahamowana, zostanie zatrzymana cała kaskada opisanych przemian i nie dojdzie do przejścia komórki z fazy G0 do fazy S, czyli zostanie zahamowany podział komórek. Ale… w związku z obecnością wirusa HPV w komórkach znajduje się jego białko – onkoproteina E7, która powoduje czynnościową inaktywację białka Rb, a to z kolei uwalnia czynnik transkrypcyjny E2F i doprowadza do przejścia komórki z Fazy G0 do fazy S. 

W badaniach wykazano, że białko p16 jest czułym markerem komórek z aktywną ekspresją onkoproteiny E7. Innymi słowy w komórkach nabłonkowych szyjki macicy, gdzie onkogenne wirusy HPV rozpoczęły transformację, poziom białka p16 jest znacznie podwyższony. Natomiast w zdrowych dojrzałych komórkach nabłonkowych szyjki macicy poziom p16 jest bardzo niski, ledwie wykrywalny. W jaki sposób ten fakt jest wykorzystywany w skriningu raka szyjki macicy? W Polsce, podobnie jak w innych krajach europejskich został stworzony program profilaktyki raka szyjki macicy. Podstawowym badaniem wykonywanym w badaniach przesiewowych raka szyjki macicy jest regularnie wykonywana cytologia, która umożliwia wykrycie zmian w nabłonku szyjki macicy w możliwie najmniej zaawansowanym stadium, często jeszcze przed wystąpieniem objawów klinicznych. 

Badanie ekspresji białka p16 jest jednym z elementów diagnostyki raka szyjki macicy. W praktyce badanie ekspresji tego białka może być wykonywane samodzielnie lub równocześnie z badaniem ekspresji białka Ki-67, które jest uznanym markerem proliferacji odzwierciedlającym tempo podziałów komórkowych stosowanym w diagnostyce i leczeniu niektórych nowotworów. Więcej informacji o białku Ki67 znajdziesz w artykule BIAŁKO Ki-67. Aby zbadać ekspresję białka p16 i białka Ki-67 wykonywany jest test immunocytochemiczny. 

Na czym polega badanie immunohistochemiczne p16/Ki-67?

Badanie wykonuje się na preparacie cytologicznym. Jeżeli została wykonana cytologa płynna (cienkowarstwowa, LBC- liquid-based cytology), to do wykonania badania można użyć wcześniej już pobranego materiału bez konieczności ponownego wykonywania wymazu. Utrwalony preparat cytologiczny poddawany jest specjalnym barwieniom przy wykorzystaniu przeciwciał przeciw białkom p16 i Ki-67.

Jeżeli w preparacie obecne są białka p16 i K-67, przeciwciała połączą się z nimi i zabarwią:

• cytoplazmę na brązowo, co świadczy o obecności białka p16
• jądra komórkowe na czerwono, co świadczy o obecności białka Ki67

Preparaty oglądane są pod mikroskopem. Test immunocytochemiczny p16/Ki-67 jest dodatni, gdy w wyniku reakcji immunocytochemicznej dochodzi w co najmniej jednej komórce nabłonka szyjki macicy do wybarwienia na kolor czerwony jądra komórkowego (ekspresja białka Ki67), a na kolor brązowy wybarwieniu ulega cytoplazma (ekspresja białka p16). Zestaw tych dwóch biomarkerów p16/Ki-67 w jednym teście zapewnia wysoką czułość i swoistość testu w wykrywaniu rzeczywistych stanów przedrakowych i raka szyjki macicy, gdyż w prawidłowych komórkach nabłonka nie stwierdza się obecności białka p16 lub jego poziom jest bardzo niski.

Co oznacza wynik p16/Ki67 dodatni?

Dodatki wynik p16 Ki67 oznacza nieprawidłowości w cyklu komórkowym, a właściwie to, że cykl ten został zaburzony w wyniku infekcji wirusem HPV. W takiej sytuacji lekarz biorąc pod uwagę pozostałe wyniki badań zdecyduje o dalszym postępowaniu.

Dla kogo wskazane jest wykonanie testu immunocytochemicznego p16/Ki67?

Według rekomendacji Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego, Polskiego Towarzystwa Kolposkopii i Patofizjologii Szyjki Macicy oraz Polskiego Towarzystwa Patologów test immunocytochemiczny badający ekspresję białek p16 i Ki67 jest szczególnie przydatny i wskazany gdy w cytologii uzyskano rozpoznanie ASC-US (atypowe komórki nabłonka wielowarstwowego płaskiego o nieokreślonym charakterze) lub LSIL (śródnabłonkowa neoplazja małego stopnia; obejmuje infekcje HPV/dysplazję małego stopnia CIN I):

• Rozpoznania ASC-US i LSIL wskazują na obecność nieprawidłowych komórek nabłonka wielowarstwowego płaskiego. Takie zmiany morfologiczne w komórkach mogą być wynikiem stanu zapalnego lub wczesnej przemiany komórek do stanu przedrakowego po rozpoczęciu procesu kancerogenezy. Dlatego też w takich przypadkach konieczne jest zróżnicowanie zmian łagodnych niewymagających żadnego leczenia z rzeczywistymi stanami przedrakowymi. W diagnostyce różnicowej wykorzystuje się właśnie biomarkery p16/Ki-67. Doświadczenie polskie wskazuje na dużą dokładność testu, która w przypadku rozpoznań stanów przedrakowych wynosi 78% (czułość jednorazowego badania cytologicznego jest oceniana na około 60%).
• Dodatni wynik testu immunocytochemicznego z wykorzystaniem przeciwciał p16 i Ki-67, który został wykonany w przypadku stwierdzenia niejednoznacznych wyników badań cytologicznych klasyfikowanych jako ASC-US, LSIL stanowi wskazanie do przeprowadzenia pogłębionej diagnostyki w kierunku raka szyjki macicy (kolposkopia i jeżeli to konieczne pobranie wycinków z najbardziej podejrzanych miejsc).

Ekspresję białka p16 ocenia się również w przypadku pogłębionej diagnostyki raka szyjki macicy wykonując test immunohistochemiczny z przeciwciałem przeciw białku p16 na wycinkach pobranych pod kontrolą kolposkopową z miejsc podejrzanych o zmiany przedrakowe lub raka szyjki macicy do oceny histopatologicznej. W takich przypadkach badanie immunohistochemiczne białka p16 pozwala wykluczyć lub potwierdzić przemianę neoplastyczną (przemianę w komórki nowotworowe) komórek nabłonka wielowarstwowego płaskiego w wycinkach z szyjki macicy:

• W prawidłowych komórkach nabłonkowych nie stwierdza się ekspresji p16 lub wykrywa się jej niską wartość. 
• W komórkach nabłonka, w których genotypy wirusa HPV o wysokim potencjale onkogennym rozpoczęły zmiany niekorzystne dla zdrowia, czyli rozpoczęły transformację nowotworową i doprowadziły do ich przemiany w zmiany przedrakowe lub raka szyjki macicy, ekspresja p16 jest znacznie podwyższona.

Mutacje genu kodującego białko P16 (gen CDKN2A)

Gen CDKN2A znajduje się na chromosomie 9 w locus 9p21. Gen ten koduje dwa białka: białko p16 i białko p14ARF, które jest odpowiedzialne za stabilizację białka p53 (jest to również białko supresorowe nowotworów). Mutacje, czyli zmiany w sekwencji genu CDKN2A mogą w sposób istotny zaburzyć funkcje biologiczne obu tych białek, przyczyniając się do ich nadmiernej lub obniżonej ekspresji. To w konsekwencji może doprowadzić do rozwoju nowotworów.

Mutacje genu CDKN2A, związane są z większym ryzykiem zachorowania na niektóre nowotwory. Patogenne zmiany w sekwencji DNA  genu CDKN2A przede wszystkim wiążą się z predyspozycją genetyczną do:

• Czerniaka – nosiciel mutacji genu CDKN2A ma ryzyko zachorowania jest wyższe o ok. 30%, a w przypadku, gdy krewni osoby z mutacją chorowali na czerniaka, to ryzyko wzrasta nawet do 60%. Częstość występowania mutacji CDKN2A różni się w zależności od położenia geograficznego, np. we Francji penetracja mutacji genu CDKN2A wśród osób chorych na czerniaka jest bardzo wysoka i wynosi 46%, w USA to ok. 18%, a w Szwecji 8%. W Polsce mutacja CDKN2A występuje w ok. 6% wszystkich czerniaków złośliwych i w 25% przypadków rodzinnego występowania czerniaka.  Czerniak związany z mutacją CDKN2A nazywany jest czerniakiem typu CMM2.
• Raka trzustki – całożyciowe ryzyko zachorowania na tę chorobę w przypadku posiadania mutacji genu CDKN2A wynosi ok. 20%. 
• Mutacje w genie CDKN2A mogą być przyczyną rodzinnego nietypowego wieloznamionowego zespołu czerniaka (Familial Atypical Multiple Mole Melanoma Syndrome, FAMMM), w którym oprócz choroby jaką jest czerniak skóry, może również dojść do rozwoju guza trzustki (tzw. zespół czerniak-rak trzustki, zespół RRTiC – Rodzinny Rak Trzustki i Czerniaka, MPCS/FAMMM-PC – melanoma-pancreatic cancer syndrome/familial atypical multiple mole melanoma-pancreatic carcinoma syndrome)

Badania wskazują również, że oprócz dziedzicznego czerniaka i raka trzustki, mutacje CDKN2A mogą się również wiązać z dziedzicznym rakiem piersi, jelita grubego i płuc.

W Polsce mutacja A148T w obrębie genu CDKN2A – występuje zdecydowanie częściej u osób chorych na czerniaka (7%), w porównaniu do całej populacji (2,9%). Ta częsta konstytucyjna zmiana – A148T, ponad dwukrotnie zwiększa ryzyko zachorowania na czerniaka niezależnie od nowotworowego wywiadu rodzinnego, zwłaszcza w młodym (poniżej 50 roku życia) wieku.

Ponadto badania wykazały, że mutacja A148T wiąże się z:

• wyższym ryzykiem zachorowania na raka piersi poniżej 50 roku życia ok. 1,5-krotnie i występuje w ok. 5% raków piersi poniżej 50 roku życia
• zwiększa ryzyko raka płuc ok. 2-krotnie
• zwiększa ryzyko raka jelita grubego ok. 1,5-krotnie (występuje w ok. 5% wszystkich raków jelita grubego)

Badania genetyczne w kierunku mutacji CDKN2A (białko p16)

Jak wygląda badanie CDKN2a?

Badania mutacji genu CDKN2A wykonywane są z krwi. Do badania nie trzeba się szczególnie przygotowywać, chociaż większość specjalistów zaleca, aby pobranie krwi zostało wykonane rano na czczo. Czas oczekiwania na wynik różni się w zależności od laboratorium i najczęściej wynosi ok. 2-4 tygodni. Najczęściej pierwszym wykonywanym badaniem jest poszukiwanie mutacji A1487T, a w drugiej kolejności, jeśli nie stwierdzi się obecności tej mutacji, wykonywane jest badanie poszukujące innych mutacji w genie CDKN2A (analiza mutacji we wszystkich czterech eksonach genu CDKN2A).

Komu zalecane jest wykonanie badania genetycznego w kierunku mutacji CDKN2A (badanie w kierunku dziedzicznego czerniaka, raka trzustki, raka płuc)?

• osobom, które zachorowały na czerniaka przed 40 rokiem życia
• osobom, w których rodzinach wystąpiły dwa lub więcej zachorowania na czerniaka lub czerniaka i inne nowotwory jak rak trzustki, rak piersi, rak płuc
• osobom, u których w rodzinie stwierdzono nosicielstwo mutacji CKDN2A

Bibliografia

1. Jach R, Mazurkiewicz M, Trzeszcz M, Zimmer M, Kędzia W, Wolski H. Cervical cancer screening in Poland in current SARS-CoV-2 pandemic: Interim guidelines of the Polish Society of Gynecologists and Obstetricians and the Polish Society of Colposcopy and Cervical Pathophysiology – a summary January 2021
2. Toussi A, Mans N, Welborn J, Kiuru M. Germline mutations predisposing to melanoma. J Cutan Pathol. 2020 Jul;47(7):606-616. doi: 10.1111/cup.13689. Epub 2020 May 11. PMID: 32249949; PMCID: PMC8232041.
3. Shi Q, Xu L, Yang R, Meng Y, Qiu L. Ki-67 and P16 proteins in cervical cancer and precancerous lesions of young women and the diagnostic value for cervical cancer and precancerous lesions. Oncol Lett. 2019 Aug;18(2):1351-1355. doi: 10.3892/ol.2019.10430. Epub 2019 Jun 3. PMID: 31423197; PMCID: PMC6607340.
4. Serra S, Chetty R. p16. J Clin Pathol. 2018 Oct;71(10):853-858. doi: 10.1136/jclinpath-2018-205216. Epub 2018 Aug 3. PMID: 30076191.
5. Gronwald J., Lubiński J. Genetyka kliniczna raka piersi i jajnika. W: Lubiński J. (red.). Genetyka kliniczna nowotworów 2017. Pomorski Uniwersytet Medyczny, Szczecin 2017; 85-111.
6. Nasierowska-Guttmejer A., Kędzia W., Rokita W. et al. Polish recommendations regarding diagnostics and treatment of cervical squamous intraepithelial lesions according to the CAP/ASCCP guidelines. Ginekol. Pol. 2016; 87 (9): 670–676 (doi: 10.5603/GP.2016.0066).
7. Miriam Reuschenbach, MD, Nicolas Wentzensen, MD, Maaike G. Dijkstra, MD, Magnus von Knebel Doeberitz, MD, Marc Arbyn, MD, p16INK4a Immunohistochemistry in Cervical Biopsy Specimens: A Systematic Review and Meta-Analysis of the Interobserver Agreement, American Journal of Clinical Pathology, Volume 142, Issue 6, December 2014, Pages 767–772.
8. Gustinucci D, Passamonti B, Cesarini E, Butera D, Palmieri EA, Bulletti S, Carlani A, Staiano M, D’Amico MR, D’Angelo V, Di Dato E, Martinelli N, Malaspina M, Spita N, Tintori B, Fulciniti F. Role of p16(INK4a) cytology testing as an adjunct to enhance the diagnostic specificity and accuracy in human papillomavirus-positive women within an organized cervical cancer screening program. Acta Cytol. 2012;56(5):506-14. doi: 10.1159/000338979. Epub 2012 Sep 27. PMID: 23075891.
9. Rayess H, Wang MB, Srivatsan ES. “Cellular senescence and tumor suppressor gene p16”. International Journal of Cancer 2012. 130 (8): 1715–25. doi:10.1002/ijc.27316. PMC 3288293. PMID 22025288.
10. Geißler CH, Tahtali A, Diensthuber M, Gassner D, Stöver T, Wagenblast J. The Role of p16 Expression as a Predictive Marker in HPV-positive Oral SCCHN – A Retrospective Single-center Study. Anticancer Research Mar 2013, 33 (3) 913-916;
11. Iaconis L, Hyjek E, Ellenson LH, Pirog EC. p16 and Ki-67 immunostaining in atypical immature squamous metaplasia of the uterine cervix: correlation with human papillomavirus detection. Arch Pathol Lab Med. 2007 Sep;131(9):1343-9. doi: 10.5858/2007-131-1343-PAKIIA. Erratum in: Arch Pathol Lab Med. 2008 Jan;132(1):13. PMID: 17824788.
12. Debniak T, Cybulski C, Górski B, Huzarski T, Byrski T, Gronwald J, Jakubowska A, Kowalska E, Oszurek O, Narod SA, Lubiński J. CDKN2A-positive breast cancers in young women from Poland. Breast Cancer Res Treat. 2007 Jul;103(3):355-9. doi: 10.1007/s10549-006-9382-x. Epub 2006 Oct 24. PMID: 17061045.
13. Debniak T, Scott RJ, Huzarski T, Byrski T, Rozmiarek A, Debniak B, Załuga E, Maleszka R, Kładny J, Górski B, Cybulski C, Gronwald J, Kurzawski G, Lubinski J. CDKN2A common variants and their association with melanoma risk: a population-based study. Cancer Res. 2005 Feb 1;65(3):835-9. PMID: 15705881.
14. Della Torre G, Pasini B, Frigerio S, Donghi R, Rovini D, Delia D, Peters G, Huot TJ, Bianchi-Scarra G, Lantieri F, Rodolfo M, Parmiani G, Pierotti MA. CDKN2A and CDK4 mutation analysis in Italian melanoma-prone families: functional characterization of a novel CDKN2A germ line mutation. Br J Cancer. 2001 Sep 14;85(6):836-44. doi: 10.1054/bjoc.2001.1991. PMID: 11556834; PMCID: PMC2375081.
15. Lal G, Liu L, Hogg D, Lassam NJ, Redston MS, Gallinger S. Patients with both pancreatic adenocarcinoma and melanoma may harbor germline CDKN2A mutations. Genes Chromosomes Cancer. 2000 Apr;27(4):358-61. PMID: 10719365.