Co to jest test Harmony?

Test Harmony™ jest genetycznym badaniem przesiewowym, który analizuje ryzyko wystąpienia określonych zaburzeń genetycznych u płodu. Test ten należy do grupy nieinwazyjnych testów prenatalnych nowej generacji, czyli NIPT (ang. Non-Invasive Prenatal Testing). Jak wszystkie testy typu NIPT jest badaniem całkowicie bezpiecznym zarówno dla kobiety ciężarnej, jak i jej dziecka.

W teście Harmony wszystkie analizy wykonywane w oparciu o obecne w krwi kobiety ciężarnej wolne pozakomórkowe DNA płodu, czyli cffDNA (ang. cell free fetal DNA). W ramach testu Harmony™ można określić płeć dziecka oraz ryzyko wystąpienia u dziecka takich aberracji chromosomowych, mogących powodować wady genetyczne jak:

• aneuploidie autosomalne (zaburzenia liczby chromosomów autosomów): trisomia 21 (zespół Downa), trisomia 18 (zespół Edwardsa), trisomia 13 (zespół Patau),
• aneuplodie allosomów (zaburzenia liczby chromosomów płci): zespół Turnera (monosomia X), zespół Klinefeltera (XXY), zespół Jacobsa (XYY), zespół XXX (trisomia X)
• oraz jeden zespół delecyjny: zespół DiGeorge’a (zespół delecji 22q11).

Test Harmony™ dostępny jest w kilku wersjach:

*wyniki testu Harmony™ dla ciąży bliźniaczej: określenie płci – obecność chromosomu Y oznaczającego płeć męską oraz prawdopodobieństwo wystąpienia nieprawidłowości chromosomów 21, 18, 13 określone jako wysokie oznaczają, że podany wynik testu dotyczy przynajmniej jednego z dwóch płodów

Test Harmony™ można wykonać w przypadku kobiet będących co najmniej w 10. tygodniu ciąży (zaleca się wykonanie testu pomiędzy 10. a 20. tygodniem ciąży).

Test można przeprowadzić u kobiet w ciąży pojedynczej, również po zapłodnieniu in vitro, bez względu na zastosowaną metodę (czyli również w ciąży, w której komórka jajowa pochodzi od dawcy), w ciąży bliźniaczej poczętej naturalnie oraz poczętej po implantacji własnej komórki jajowej.

Dla ciąży pojedynczej test został zwalidowany do określenia płci płodu i ryzyka wystąpienia nieprawidłowości liczby chromosomów 21, 18, 13, X, Y oraz zespołu DiGeorge’a. W przypadku ciąż bliźniaczych test zwalidowano do oceny ryzyka wystąpienia trisomii 21, 18, 13 oraz określenia płci płodu. Test nie określa ryzyka wystąpienia częściowych trisomii, mozaikowatości i translokacji.

Metodologia testu Harmony™ i przebieg badania

Nieinwazyjny test prenatalny Harmony™ został opracowany i wprowadzony na rynek w 2012 roku przez laboratorium kliniczne Ariosa Diagnostics (San Jose, USA). Laboratorium to jest certyfikowane przez CLIA (ang. the Clinical Laboratory Improvement Amendments) oraz akredytowane przez CAP (ang. College of American Pathologists).

Certyfikat CLIA jest przyznawany przez amerykański odpowiednik Ministerstwa Zdrowia i wskazuje laboratoria, w których utrzymane są standardy zapewniające najwyższą jakość przeprowadzanych testów. Akredytacja CAP oznaczająca najwyższą jakość i kwalifikacje personelu, jest przyznawana przez stowarzyszenie międzynarodowe dla laboratoriów, które już mają przynajmniej jeden z innych certyfikatów, np. CLIA, FDA. Laboratorium Ariosa Diagnostics zostało przejęte w 2015 roku przez firmę Roche.

Technologia testu Harmony™ opiera się na wykorzystaniu metody mikromacierzy DNA – DANSR™ (ang. Digital Analysis of Selected Regions). Metoda mikromacierzy DNA jest rodzajem analizy celowanej, w której do sekwencjonowania wykorzystuje się nie cały pobrany materiał genetyczny, a określone, specjalnie wyselekcjonowane fragmenty DNA (w tym przypadku cffDNA) znajdujące się na tych chromosomach, których nieprawidłowości są analizowane.

Dane uzyskane z sekwencjonowania analizowane są w oparciu o opracowany przez firmę algorytm FORTE™ (ang. Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation). Test ten posiada europejski certyfikat CE na cały proces technologiczny (wysoka jakość i wiarygodność badania została zwalidowana i potwierdzona). Efektywność diagnostyczna i ocena kliniczna testu została potwierdzona w licznych badaniach (59 publikacji naukowych), w których wzięło udział ponad 218 tys. kobiet w ciąży.

Czułość testu Harmony™ łącznie dla trisomii 21, 18, 13 wynosi 99%. Test ma również bardzo niski odsetek wyników fałszywie dodatnich 0,15%. Analiza allosomów pozwala na określenie płci z dokładnością ponad 99%. W przypadku analizy ryzyka wystąpienia u płodu zespołu DiGeorge’a (zespół delecji 22q11) wykonano walidację analityczną oraz kliniczną oceną efektywności testu na 1953 próbkach. Test został zwalidowany do detekcji mikrodelecji 22q11 o rozmiarze 3 Mb (milionów par zasad) i mniejszych. Wg przeprowadzonych przez firmę badań 85% występujących w badanych próbkach mikrodelecji tego regionu miało rozmiar „standardowy” 3 Mb, pozostałe 15% były to mniejsze delecje (2Mb, 1,5 Mb). Najmniejsza wykryta delecja 22q11 miała rozmiar 1,96 Mb. Skumulowana czułość testu dla zespołu DiGeorge’a wynosi 75,2%, a specyficzność 99,6%.

W celu wykonania testu Harmony™ należy pobrać niewielką ilości krwi (20 ml) od kobiety ciężarnej. Do pobrania krwi nie trzeba się przygotowywać w żaden szczególny sposób, nie ma również potrzeby, aby być na czczo.

Ocena ryzyka wystąpienia ewentualnych nieprawidłowości chromosomowych u dziecka jest oparta na analizie wolnego pozakomórkowe DNA płodu, czyli cffDNA (ang. cell free fetal DNA). W krwi kobiety ciężarnej znajduje się mieszanina cfDNA (ang. cell free DNA – wolne pozakomórkowe DNA) matki i płodu. Wolne pozakomórkowe DNA płodowe (cffDNA, ang. cell free fetal DNA) stanowi ok. 10-15% całego cfDNA krążącego we krwi matki.

Z pobranej krwi izolowane jest cfDNA (wolne pozakomórkowe DNA), które następnie nanoszone jest na mikromacierz. Tam znajdują się specjalnie wyselekcjonowane sondy, z którymi łączy się cfDNA. Dzięki zastosowaniu sond, analizie poddawane są tylko wybrane, interesujące nas fragmenty DNA znajdujące się na chromosomach 21, 18, 13 oraz X i Y (analiza celowana – DANSR™, ang. Digital Analysis of Selected Regions). Związane w ten sposób fragmenty DNA poddawane są następnie amplifikacji (powielaniu) metodą PCR oraz sekwencjonowaniu.

Uzyskane w ten sposób dane są w dalszej kolejności analizowane zgodnie z algorytmem FORTE™ (ang. Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation). Algorytm ten w analizie dodatkowo uwzględnia m.in. dokładny pomiar pokazujący procentowy udział wolnego pozakomórkowego DNA płodu (cffDNA, ang. cell free fetal DNA) w całym cfDNA (ang. cell free DNA) znajdującym się w próbce krwi, wiek matki oraz wiek ciąży. Do precyzyjnego określenia ilości cffDNA w próbce dodatkowo wykorzystuję się analizy SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism – polimorfizm pojedynczego nukleotydu).

Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu są najczęściej występującym rodzajem zmian genetycznych w ludzkim genomie i obejmują ok. 90% całej zmienności materiału genetycznego. Dotyczą one zmiany jednego nukleotydu w sekwencji DNA i najczęściej są wynikiem błędów powstałych w trakcie replikacji DNA. Rezultatem takiego błędu jest wypadnięcie (delecja), wstawienie (insercja) bądź zamiana jednego nukleotydu na inny w sekwencji DNA. Szacuje się, że zmiany typu SNP dotyczą średnio jednego nukleotydu na 300. Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu odpowiadają za różnorodność i zmienność genetyczną. Większość polimorfizmów pojedynczego nukleotydu występujących u ludzi dotyczy takich właśnie zmian i nie ma wpływu na zdrowie człowieka. Powodują one, że w populacji występuje wiele wariantów tego samego genu, co z kolei uzewnętrznia się w m.in. naszych cechach fenotypowych, jak np. wygląd zewnętrzny, kolor skóry, poziom markerów biochemicznych we krwi. Wiemy, że w sekwencji DNA występują sekwencje kodujące genu (eksony/egzony) i niekodujące (introny). Te pierwsze, kodują sekwencję aminokwasów w białku. Jeżeli zdarzy się, że SNP wystąpi w sekwencji kodującej genu, może to spowodować zmiany w sekwencji aminokwasów w białku, przez co to białko może całkowicie lub częściowo utracić swoją funkcję. W takiej sytuacji polimorfizm pojedynczego nukleotydu będzie miał wpływ na rozwój choroby. W teście Harmony analiza SNP występujących w badanym cfDNA (ang. cell free DNA, wolne pozakomórkowe DNA) pozwala na bardziej precyzyjny pomiar zawartości cffDNA (ang. cell free fetal DNA) w całym cfDNA w próbce.

 Więcej informacji na temat samej techniki SNP znajdziesz na podstronie opisującej test PANORAMA.

Wyniki testu Harmony™

Test Harmony™ wykonywany jest w Niemczech. Czas oczekiwania na wyniki wynosi ok. 14 dni roboczych od momentu przyjęcia próbki przez laboratorium. Dzięki zastosowanym metodom analitycznym, wysoka skuteczność i precyzja badania jest możliwa przy zawartości frakcji płodowej na poziomie 4% lub wyższej.

Przeprowadzając test Harmony™ można określić ryzyko wystąpienia u płodu następujących nieprawidłowości genetycznych:

TRISOMIE:

• zespół Downa (trisomia 21)
• zespół Edwardsa (trisomia 18)
• zespół Patau (trisomia 13)

ZABURZENIA LICZBY CHROMOSOMÓW PŁCI:

• zespół Turnera (monosomia X)
• zespół Klinefeltera (XXY)
• zespół Jacobsa (XYY)
• zespół XXX (trisomia X)

ZESPÓŁ DELECYJNY:

• zespół DiGeorge’a (delecja 22q11)

ROZPOZNANIE PŁCI DZIECKA:

• dziewczynka/chłopiec (w przypadku ciąży bliźniaczej wykrycie obecności chromosomu Y oznacza, że przynajmniej jeden z bliźniaczych płodów to chłopiec)
  

Ocena ryzyka wystąpienia u płodu trisomii 21, 18, 13 oraz rozpoznanie płci wykonywane są zarówno w przypadku ciąży pojedynczej, jak i bliźniaczej. Wersje testu Harmony™ z opcją oceny aneuploidii chromosomów płci oraz zespołu DiGeorge’a wykonywane są wyłącznie dla ciąży pojedynczej.

Ocena kliniczna efektywności testu Harmony™ dla trisomii 21, 18, 13

Walidacja analityczna i ocena kliniczna efektywności testu Harmony™ dla Zespółu DiGeorge’a

*Czułość testu określa jaką dany test ma zdolność do wykrywania/rozpoznania choroby, np. w przypadku testu Harmony™ czułość testu dla trisomii 21 w ocenie klinicznej efektywności testu wynosi 99,3%, co oznacza, że test ten prawidłowo weryfikuje obecność trisomii 21 w 99,3% przypadków.

**Wynik fałszywie pozytywny określa jakie jest prawdopodobieństwo, że otrzymany wynik wysokie ryzyko nie jest prawidłowy. Tabela pokazuje jaki jest % wyników fałszywie dodatnich dla poszczególnych analizowanych nieprawidłowości genetycznych.

***Specyficzność testu określa jaką dany test ma zdolność do wykrywania/rozpoznania wyników prawidłowych, oznaczających brak choroby, np. w przypadku testu Harmony™ w specyficzność testu w przypadku badania zespołu DiGeorge’a wynosi 99,6%, co oznacza, że na wszystkie wyniki zbadane jako prawidłowe, czyli oznaczające brak choroby, w 99,6% przypadkach będzie to wynik prawdziwy.

Przedział ufności (95%CI)- pokazuje nam, że obliczona testami statystycznymi wartość (np. czułość, testu przesiewowego, ilość wyników fałszywie dodatnich) mieści się w pewnym przedziale z założonym prawdopodobieństwem (innymi słowy przedział ufności pokazuje nam na ile możemy ufać danej wartości). Analizy statystyczne umożliwiają nam wnioskowanie jak badana wartość rozkłada się w populacji pomimo, że badanie/testy były wykonywane na części populacji, czyli tzw. próbie badawczej. Przedział ufności 95%CI oznacza założone w testach statystycznych prawdopodobieństwo 95%. Takie założenie jest konieczne jeżeli nie robimy testów na całej populacji, tylko na wybranej grupie reprezentatywnej (próba badawcza) – a tak jest najczęściej. W zależności od wielkości grupy badanej możemy natomiast z pewnym prawdopodobieństwem, np. 90%, 95%, 99% podać przedziały (nasze przedziały ufności), w których mieści się (znajduje się) poszukiwana przez wartość. Np. w przypadku testu Harmony™ czułość testu dla trisomii 21 w ewaluacji klinicznej wynosi 99,3%, co oznacza, że test ten prawidłowo weryfikuje obecność trisomii 21 w 99,3% przypadków przy przedziale ufności 95%CI: 97,9-99,8%, czyli prawdziwy poziom czułości testu dla trisomii 21 mieści się w przedziale 97,9-99,8% dla 95% populacji.

Otrzymane wyniki testu Harmony™ wskażą nam czy istnieje ryzyko nieprawidłowości chromosomowej dla chromosomów pary 21, 18, 13 oraz chromosomów płci (w przypadku ciąży pojedynczej) wraz z informacją jaki był udział procentowy cffDNA (wolnego pozakomórkowego DNA płodu, ang. cell free fetal DNA) w całym cfDNA (wolnym pozakomórkowym DNA, ang. cell free DNA) w badanej próbce.

Wynik opisywany jest jako niskie lub wysokie ryzyko wystąpienia danej aberracji chromosomowej wraz z podaniem prawdopodobieństwa. Prawdopodobieństwo wystąpienia danej nieprawidłowości chromosomowej poniżej 1% określane jest jako niskie ryzyko (w karcie wyniku podana jest konkretna informacja przy każdej aberracji, np. trisomia 21 – niskie prawdopodobieństwo 0,01% – 1/10000). Każde prawdopodobieństwo powyżej 1% określane jest jako wysokie ryzyko (wynik podaje informację np. monosomia X – wysokie prawdopodobieństwo 99% – 99/100).

W przypadku ciąż bliźniaczych – jeżeli rezultat testu będzie wskazywał na wysokie ryzyko wystąpienia jednej z trisomii (dla chromosomów 21, 18, 13), oznacza to, że takie ryzyko dotyczy przynajmniej jednego z płodów bliźniaczych. Dla każdej z trisomii 21, 18, 13 wynik opisywany jest oddzielnie. Dla aneuploidii chromosomów płci w przypadku jest ryzyko ich wystąpienia jest niskie, wynik podany jest łącznie dla całego panelu testowanych aberracji chromosomów X i Y. Jeżeli oceniane ryzyko wystąpienia jednej z nieprawidłowości chromosomów płci jest wysokie, wynik ten jest wskazany oddzielnie. Wynik analizy ryzyka wystąpienia zespołu DiGeorge’a (mikrodelecji 22q11) opisywany jest jako niskie/wysokie prawdopodobieństwo wystąpienia tej mikrodelecji. Otrzymany wynik należy skonsultować z lekarzem.

Istotne jest, aby pamiętać, że wynik określający ryzyko wystąpienia wady genetycznej jako wysoki nie jest tożsamy i jednoznaczny z diagnozą i rozpoznaniem choroby genetycznej.

Dlatego tak ważna jest konsultacja z lekarzem, który zinterpretuje i wytłumaczy otrzymane wyniki oraz zadecyduje o ewentualnej dalszej diagnostyce. W przypadku otrzymania wyniku nieprawidłowego zaleca się weryfikację poprzez przeprowadzenie inwazyjnych badań prenatalnych polegających na analizie materiału genetycznego pochodzącego z komórek płodu (np. amniopunkcja). W sytuacji gdy rodzice nie zdecydują się na takie badania, po urodzeniu dziecko kierowane jest do poradni genetycznej, gdzie wykonuje się genetyczne badania kariotypu.

Wskazania i przeciwwskazania do wykonania testu Harmony™

Przeprowadzenie testu Harmony™ jest zalecane gdy:

• wiek matki jest wyższy niż 35 lat – wraz z wiekiem matki wzrasta prawdopodobieństwo występowania wad genetycznych u płodu
• ciąża jest wynikiem zapłodnienia in vitro – test Harmony™ można wykonywać w przypadku ciąż z zapłodnienia in vitro bez względu na zastosowaną metodę (implantacja własnej komórki jajowej bądź komórki jajowej pochodzącej od dawcy) 
• występują przeciwwskazania do inwazyjnej diagnostyki prenatalnej – np. zwiększone ryzyko poronienia, zakażenie wirusem (np. HIV, WZW B)
• z poprzedniej ciąży urodziło się dziecko z wadą genetyczną
• w materiale genetycznym rodzica obecna jest zrównoważona translokacja robertsonowska, (translokacja robertsonowska może nie ujawniać się fenotypowo u rodzica, a może prowadzić do trisomii 13 bądź 21 u dziecka)
• wyniki USG płodu oraz wyniki testów biochemicznych są nieprawidłowe
• rodzice są zaniepokojeni pomimo prawidłowych wyników rutynowych badań

Przeciwwskazania do wykonania testu Harmony™:

• ciąża poniżej 10. tygodnia
• wiek kobiety ciężarnej poniżej 18 r.ż.
• ciąża mnoga powyżej 2 płodów
• kobieta w ciąży jest po przeszczepie szpiku bądź narządu
• choroba nowotworowa z przerzutami